El Servicio de Interacciones Moleculares se encarga del estudio cuantitativo (tamaño, masa molecular, estado de asociación/estequiometría y afinidad) de macromoléculas y complejos macromoleculares en disolución, además de prestar asesoramiento y apoyo al usuario en la ejecución de técnicas biofísicas de dispersión de luz dinámica (DLS) y estática multiángulo (SEC-MALS),  interferometría de biocapa (BLI) y espectroscopía de correlación de fluorescencia.

Actualmente el Servicio posee equipos de Ultracentrifugación Analítica (AUC), Dispersión de Luz Dinámica (DLS), Cromatografía de Exclusión Molecular acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (SEC-MALS), Interferometría de Biocapa (BLI) y Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS).

 

La Ultracentrifugación Analítica consiste en un conjunto de métodos (velocidad y equilibrio de sedimentación) que permiten la determinación del tamaño, la forma global aproximada, y el grado de homogeneidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos métodos están especialmente adaptados para la detección y la caracterización cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría, reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formación de complejos macromoleculares, incluyendo las interacciones proteína-proteína, DNA-proteína y receptor-ligando [Howlett et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz et al. (2002) Protein Sci. 11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas et al. (1999) Methods 19:194-212].

 

XLA & XLIVSSV Peaks

  • La Unidad posee dos ultracentrífugas analíticas Beckman-Coulter: una Optima XLA equipada con un sistema de detección de absorción UV-VIS y una Optima XLI con dos sistemas de detección integrados, UV-VIS de longitud de onda variable e interferencia de Raleigh. Esta última técnica permite el estudio de macromoléculas en disoluciones con alta absorción en el UV-VIS.
  • Desde su creación en 1994, esta Unidad del CIB ha dado apoyo científico-técnico en la caracterización biofísica de proteínas y sus interacciones a un gran número de grupos de investigación del CSIC, universidades, empresas, así como a otros centros de investigación nacionales y extranjeros. La Unidad cuenta con el asesoramiento y la colaboración de grandes expertos internacionales en estas metodologías. En 2009 el laboratorio consiguió la certificación conforme a la norma ISO9001 con el código ER-0286/2009.

 

La Dispersión de Luz Dinámica proporciona información rápida y complementaria a la obtenida mediante ultracentrifugación analítica, aportando dos grandes ventajas frente a otros métodos analíticos: el bajo volumen de muestra requerido (15-45 µl) y la rapidez en la obtención de los resultados (<10 min). La técnica permite conocer el grado de polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusión traslacional de las especies macromoleculares en disolución y calcular su radio hidrodinámico. Este equipo (modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo muy sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Peltier (4-60ºC) y se puede utilizar para el análisis de diferentes tipos de macromoléculas como proteínas, polisacáridos, nanopartículas y micelas lipídicas.       

                    

     MALS  DLS   DLS Plot

 

La Cromatografía de Exclusión Molecular Acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (modelo DAWN-EOS, Wyatt Inc.) separa las diferentes especies presentes en la muestra en función de su tamaño y mide simultáneamente su concentración (modelo Optilab rEX, Wyatt Inc.) y la intensidad de la luz dispersada, de manera que permite la obtención de su masa molecular.

También se puede utilizar para el estudio de interacciones macromoleculares en disolución mediante la formación de un gradiente de concentraciones (método CG-MALS) [ver Attri & Minton (2005) Anal. Biochem. 337:103-110]. En este último caso se utiliza una bomba programable de triple jeringa (modelo CALYPSO, Wyatt Inc.) para la inyección secuencial de concentraciones variables de proteína/s y tampón. La información sobre la interacción se obtiene en pocos minutos (importante cuando la estabilidad del sistema es un factor a considerar).

  • Recientemente se han realizado en esta Unidad diferentes estudios sobre los procesos de oligomerización y polimerización de proteínas, mediante el uso combinado de las técnicas de ultracentrifugación y dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362; del Castillo et al. (2011) Biochemistry, 50: 1991–2003).

 

La Interferometría de Biocapa (BLI) es una técnica óptica rápida y sencilla para estudiar las interacciones entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeños ligandos y lípidos, en tiempo real, empleando volúmenes de muestra muy pequeños (4,5 µL). La técnica proporciona información sobre afinidades de unión y tasas de asociación y disociación entre una molécula, inmovilizada en un biosensor de fibra óptica y un analito en solución. Las bajas concentraciones de muestra empleadas (nM) la hacen especialmente interesante para proteínas de difícil purificación, con la ventaja de poder estudiar las interacciones incluso en lisados heterogéneos, dado que el patrón de interferencia no se ve afectado por los cambios en el índice de refracción del medio.              

                                                       BLItz     Sensogram

 

  • El Servicio ha adquirido un interferómetro de biocapa ForteBioBLItzTM junto con un conjunto de biosensores, de un solo uso, funcionalizados con Ni-NTA, Aminopropilsilano (APS), Proteína A y Aminas Reactivas de Segunda Generación.

 

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es la última técnica que está incorporando el Servicio. Permite evaluar las fluctuaciones temporales de la intensidad de fluorescencia para obtener información sobre la movilidad de las moléculas, que está relacionada con su tamaño y forma. De esta manera, se puede estudiar la polimerización y agregación de proteínas. FCS también es una poderosa herramienta para la detección y medida de interacciones moleculares que generan complejos sustancialmente más grandes que las especies libres. La técnica de FCS constituye un complemento ideal para otras metodologías disponibles en el Servicio, como la ultracentrifugación analítica y la dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362).

 

FCS microscopio

fcs plot

 

  • El equipo disponible en el Servicio es un microscopio confocal de fluorescencia resuelta en el tiempo, MicroTime 200 (PicoQuant), con sensibilidad de una sola molécula, excitación mediante dos láseres pulsados de picosegundos (481 + 635) nm, PicoHarp 300, escaneado 3D y cuatro canales de detección (con dos MPD y dos AQR-SPAD).
 

Instrucciones

El Servicio de Ultracentrifugación Analítica y Dispersión de Luz ha establecido unas tarifas ajustadas a cubrir mínimamente el uso del equipamiento y su mantenimiento, que varían dependiendo de la Institución a la que pertenezca el usuario (CSIC, universidades, centros de investigación ajenos al CSIC y empresas). Las tarifas incluyen:

  • El diseño experimental en los experimentos de Ultracentrifugación analítica.
  • La adquisición de los datos.
  • Ensamblaje, desmontado y limpieza de celdas de ultracentrifugación.
  • Suministro de archivos con datos en crudo
  • Informe detallando la calidad de la muestra (heterogeneidad, grado de asociación, etc.), coeficiente de sedimentación y masa molecular promedio (sólo en el método de equilibrio de sedimentación).

El análisis en detalle, la interpretación de los resultados y la preparación de figuras y texto para su publicación no están incluidas en el servicio, sino que, en caso necesario, pueden incluirse en la categoría de “colaboración” cuyas condiciones serán negociadas por adelantado entre el investigador principal del grupo usuario y el personal del Servicio.

Solicitud de Pedido on-line (clic aquí)

Lista de Precios (clic aquí)

Para más información contactar con:

 

Miembros

Técnicos
Oscar Mariano Nuero García
Técnicos de Plantilla
Juan Roman Luque Ortega