El Servicio de Ultracentrifugación Analítica y Dispersión de Luz se encarga del análisis cuantitativo del tamaño y estado de asociación de macromoléculas y complejos macromoleculares en disolución, además de prestar apoyo al usuario en la ejecución de la técnica de dispersión de luz dinámica (DLS) e interferometría de biocapa (BLI)..

 

La Ultracentrifugación Analítica consiste en un conjunto de métodos (velocidad y equilibrio de sedimentación) que permiten la determinación del tamaño, la forma global aproximada, y el grado de homogeneidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos métodos están especialmente adaptados para la detección y la caracterización cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría, reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formación de complejos macromoleculares, incluyendo las interacciones proteína-proteína, DNA- proteína y receptor-ligando [Howlett et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz et al. (2002) Protein Sci. 11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas et al. (1999) Methods 19:194-212].

Certificación AENOR en ISO9001.

  • La Unidad posee una ultracentrífuga analítica modelo XL-I equipada con dos sistemas ópticos de detección: UV-VIS de longitud de onda variable e interferencia de Raleigh. Esta última técnica permite el estudio de macromoléculas en disoluciones con alta absorción en el UV-VIS.
  • Desde su creación en 1994, esta Unidad del CIB ha dado apoyo científico-técnico en la caracterización biofísica de proteínas y sus interacciones a un gran número de grupos de investigación del CSIC, universidades, empresas, así como a otros centros de investigación nacionales y extranjeros. Esta Unidad cuenta con el asesoramiento y la colaboración de grandes expertos internacionales en estas metodologías. En 2009 el laboratorio consiguió la certificación conforme a la norma ISO9001 con el código ER-0286/2009.

La Dispersión de Luz Dinámica proporciona información rápida y complementaria a la obtenida mediante ultracentrifugación analítica, aportando dos grandes ventajas frente a otros métodos analíticos como el bajo volumen de muestra requerido (15-45 µl) y la rapidez en la obtención de los resultados (<10 min). La técnica permite conocer el grado de polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusión traslacional de las especies macromoleculares en disolución y calcular su radio hidrodinámico. Este equipo (modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo muy sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Peltier (4-60ºC) y se puede utilizar para el análisis de diferentes tipos de macromoléculas como proteínas, polisacáridos y micelas lipídicas.

  • Con posterioridad se ha introducido en la Unidad un equipo de dispersión de luz estática multiángulo (modelo DAWN-EOS, Wyatt Inc.) conectado a un equipo de determinación de la concentración por índice de refracción (modelo Optilab rEX, Wyatt Inc.), con dos posibles aplicaciones en nuestro laboratorio. Puede acoplarse a un sistema de cromatografía líquida de exclusión molecular (método SEC-MALS) para la determinación de la masa molecular de las macromoléculas separadas por columna. También se puede utilizar para el estudio de interacciones macromoleculares en disolución mediante la formación de un gradiente de concentraciones (método CG-SLS) [ver Attri & Minton (2005) Anal. Biochem. 337:103-110]. En este último caso se utiliza una bomba programable de triple jeringa (modelo CALYPSO, Wyatt Inc.) para la inyección secuencial de concentraciones variables de proteína/s y buffer. La información sobre la interacción se obtiene en pocos minutos (importante cuando la estabilidad del sistema es un factor a considerar).
  • Recientemente se han realizado en esta Unidad diferentes estudios sobre los procesos de oligomerización y polimerización de proteínas, mediante el uso combinado de las técnicas de ultracentrifugación y dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362; del Castillo et al. (2011) Biochemistry, 50: 1991–2003).

La Interferometría de Biocapa(BLI) es una técnica óptica rápida y sencilla para estudiar las interacciones entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeños ligandos y lípidos, en tiempo real, empleando volúmenes de muestra muy pequeños (4,5 µL). La técnica proporciona información sobre afinidades de unión y tasas de asociación y disociación entre una molécula, inmovilizada en un biosensor de fibra óptica y un analito en solución. Las bajas concentraciones de muestra empleadas (nM) la hacen especialmente interesante para proteínas de difícil purificación, con la ventaja de poder estudiar las interacciones incluso en lisados heterogéneos, dado que el patrón de interferencia no se ve afectado por los cambios en el índice de refracción del medio.

  • El Servicio ha adquirido un interferómetro de biocapa ForteBioBLItzTM junto con un conjunto de biosensores, de un solo uso, funcionalizados con Ni-NTA, Aminopropilsilano (APS), Proteína A y Aminas Reactivas de Segunda Generación.
 

Instrucciones

El Servicio de Ultracentrifugación Analítica y Dispersión de Luz ha establecido unas tarifas ajustadas a cubrir mínimamente el uso del equipamiento y su mantenimiento, que varían dependiendo de la Institución a la que pertenezca el usuario (CSIC, universidades, centros de investigación ajenos al CSIC y empresas). Las tarifas incluyen:

  • El diseño experimental en los experimentos de Ultracentrifugación analítica.
  • La adquisición de los datos.
  • Ensamblaje, desmontado y limpieza de celdas de ultracentrifugación.
  • Suministro de archivos con datos en crudo
  • Informe detallando la calidad de la muestra (heterogeneidad, grado de asociación, etc.), coeficiente de sedimentación y masa molecular promedio (sólo en el método de equilibrio de sedimentación).

El análisis en detalle, la interpretación de los resultados y la preparación de figuras y texto para su publicación no están incluidas en el servicio, sino que, en caso necesario, pueden incluirse en la categoría de “colaboración” cuyas condiciones serán negociadas por adelantado entre el investigador principal del grupo usuario y el personal del Servicio.

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Miembros

Técnicos
Jorge Martínez Guijarro
Técnicos de Plantilla
Juan Roman Luque Ortega