Interacciones Moleculares

La Ultracentrifugación Analítica consiste en un conjunto de métodos (velocidad y equilibrio de sedimentación) que permiten la determinación del tamaño, la forma global aproximada, y el grado de homogeneidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos métodos están especialmente adaptados para la detección y la caracterización cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría, reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formación de complejos macromoleculares, incluyendo las interacciones proteína-proteína, DNA-proteína y receptor-ligando [Howlett et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz et al. (2002) Protein Sci. 11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas et al. (1999) Methods 19:194-212].

Desde su creación en 1994, esta Unidad del CIB ha dado apoyo científico-técnico en la caracterización biofísica de proteínas y sus interacciones a un gran número de grupos de investigación del CSIC, universidades, empresas, así como a otros centros de investigación nacionales y extranjeros. La Unidad cuenta con el asesoramiento y la colaboración de grandes expertos internacionales en estas metodologías y ha participado en más de 300 publicaciones desde su fundación.

La Dispersión de Luz Dinámica proporciona información rápida y complementaria a la obtenida mediante ultracentrifugación analítica, aportando dos grandes ventajas frente a otros métodos analíticos: el bajo volumen de muestra requerido (15-45 µl) y la rapidez en la obtención de los resultados (<10 min). La técnica permite conocer el grado de polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusión traslacional de las especies macromoleculares en disolución y calcular su radio hidrodinámico. Este equipo (modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo muy sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Peltier (4-60ºC) y se puede utilizar para el análisis de diferentes tipos de macromoléculas como proteínas, polisacáridos, nanopartículas y micelas lipídicas. 

La Cromatografía de Exclusión Molecular Acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (modelo DAWN-EOS, Wyatt Inc.) separa las diferentes especies presentes en la muestra en función de su tamaño y mide simultáneamente su concentración (modelo Optilab rEX, Wyatt Inc.) y la intensidad de la luz dispersada, de manera que permite la obtención de su masa molecular.

También se puede utilizar para el estudio de interacciones macromoleculares en disolución mediante la formación de un gradiente de concentraciones (método CG-MALS) [ver Attri & Minton (2005) Anal. Biochem. 337:103-110]. En este último caso se utiliza una bomba programable de triple jeringa (modelo CALYPSO, Wyatt Inc.) para la inyección secuencial de concentraciones variables de proteína/s y tampón. La información sobre la interacción se obtiene en pocos minutos (importante cuando la estabilidad del sistema es un factor a considerar).

• En esta Unidad se han realizado diferentes estudios sobre los procesos de oligomerización y polimerización de proteínas, mediante el uso combinado de las técnicas de ultracentrifugación y dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362; del Castillo et al. (2011) Biochemistry, 50: 1991–2003).

La Interferometría de Biocapa (BLI) es una técnica óptica rápida y sencilla para estudiar las interacciones entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeños ligandos y lípidos, en tiempo real, empleando volúmenes de muestra muy pequeños (4,5 µL). La técnica proporciona información sobre afinidades de unión y tasas de asociación y disociación entre una molécula, inmovilizada en un biosensor de fibra óptica y un analito en solución. Las bajas concentraciones de muestra empleadas (nM) la hacen especialmente interesante para proteínas de difícil purificación, con la ventaja de poder estudiar las interacciones incluso en lisados heterogéneos, dado que el patrón de interferencia no se ve afectado por los cambios en el índice de refracción del medio.         

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) permite evaluar las fluctuaciones temporales de la intensidad de fluorescencia para obtener información sobre la movilidad de las moléculas, que está relacionada con su tamaño y forma. De esta manera, se puede estudiar la polimerización y agregación de proteínas. FCS también es una poderosa herramienta para la detección y medida de interacciones moleculares que generan complejos sustancialmente más grandes que las especies libres. La técnica de FCS constituye un complemento ideal para otras metodologías disponibles en el Servicio, como la ultracentrifugación analítica y la dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362).

Las medidas de intensidad y anisotropía/polarización de fluorescencia permiten la detección y cuantificación de interacciones moleculares, incluyendo aquellas en las que participan proteínas, ácidos nucleicos, péptidos y ligandos, con alta sensibilidad y bajo consumo de muestra. La anisotropía es especialmente adecuada para este propósito, dado que depende del volumen molecular y, por lo tanto, es sensible a cambios de tamaño que tienen lugar al formarse los complejos.  La alta sensibilidad de estas medidas (picomolar), posibilita la evaluación de interacciones de alta afinidad en condiciones de equilibrio. Utilizando lectores de placas, las medidas pueden realizarse rápida y simultáneamente en cientos de muestras de bajo volumen (unos pocos microlitros), lo que abre la puerta al desarrollo de ensayos sistemáticos de interés en biotecnología y biomedicina.

Grupos de Investigación y Usuarios del Servicio.

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