Descripción
El paso clave en la biodegradación de la lignina es la oxidación extracelular por H2O2 (generado por oxidasas) catalizada por peroxidasas de alto potencial redox. El proceso presenta interés para oxidar una variedad de compuestos aromáticos. Los solicitantes han clonado, caracterizado y expresado en forma heteróloga dos enzimas que actúan sinérgicamente en el ataque a la lignina por Pleurotus eryngii. Se trata de: i) un nuevo tipo de peroxidasa, que denominamos peroxidasa versátil (VP) por su capacidad para oxidar sustratos típicos de las otras dos peroxidasas ligninolíticas (lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa, con las que comparte 54-61% de secuencia); y ii) una oxidasa, aril-alcohol oxidasa (AAO), que produce H2O2 durante la oxidación de alcoholes aromáticos (con 34% de identidad de secuencia con la glucosa oxidasa de Aspergillus niger). El objetivo es conocer su estructura molecular, con especial atención a los sitios de unión a sustratos, utilizando diferentes técnicas (incluyendo mutagénesis dirigida, difracción de rayos-x, 1H-NMR, MALDI-TOF, modelado molecular, dicroismo circular, biosensor óptico y “stopped flow”). Para la obtención de VP recombinante (VP*) se utilizará la expresión en Escherichia coli y replegado “in vitro” (ya optimizado), mientras que la AAO* será inicialmente obtenida en Emericella nidulans. Existen ya condiciones de cristalización para ambas proteínas por lo que se espera disponer en breve de modelos cristalográficos. En el caso de la VP, se pretende además: i) confirmar el papel de los tres residuos ácidos que constituirían el sitio de unión de Mn2+ junto al propionato interno del hemo (propuesto a partir de los primeros modelos moleculares y resultados de mutagénesis); ii) identificar los sitios implicados en la oxidación de sustratos aromáticos, incluyendo posibles rutas de transferencia electrónica de largo rango (una de ellas a partir de un Trp superficial) u oxidación directa en el canal de hemo; y iii) modular la actividad sobre diferentes sustratos mediante modificación de los correspondientes sitios de unión. En el caso de la AAO, se plantea: i) identificar los residuos catalíticos (incluyendo dos histidinas junto al anillo de flavina) y el mecanismo de catálisis; y ii) definir la arquitectura de su bolsillo de unión a sustratos que es capaz de unir eficazmente alcoholes poli-insaturados con estructuras moleculares muy diferentes.
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