La determinación de la masa molecular por espectrometría de masas.

La separación de proteínas mediante electroforesis de geles bidimensionales.

 

El Servicio de Proteómica y Genómica del CIB es un servicio de apoyo científico y tecnológico a la investigación, tanto para los investigadores del CIB, como para los investigadores de otros centros e instituciones. El Servicio pertenece a la red ProteoRed integrada en la Plataforma de Recursos Biomoleculares y Bioinformáticos (PRB2) del Instituto de Salud Carlos III y está integrado en la RED de laboratorios de la Comunidad de Madrid. Desde 2012 el laboratorio está certificado conforme a la norma ISO9001 con el código ER-0286/2009 Certificación AENOR en ISO9001.

 

Encuestas de satisfacción 2016.

 

 

PROTEÓMICA

 

En el Servicio se pueden realizar la separación, cuantificación, identificación y caracterización de proteínas de organismos procarióticos y eucarióticos mediante electroforesis bidimensional, cromatografía líquida multidimensional -masas (LTQ Orbitrap Velos) y espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

 

El equipamiento actual del Servicio es el siguiente:

 

  • 2 unidades de isoelectroenfoque Protean IEF cell (BIO-RAD), para la primera dimensión de los geles 2D en tiras de 7 y 18 cm de diferentes rangos de pH: 3-10 no lineal, 3-10-lineal y 4-7 lineal.
  • 1 Cubeta multigel Miniprotean Dodecacell (BIO_RAD), para la electroforesis simultánea de hasta 12 geles de 8 x 7 cm. Este equipamiento permite la optimización de las condiciones de separación electroforética con una menor cantidad de muestra y un bajo coste.
  • 1 Cubeta Protean II Multicell (BIO_RAD), para la electroforesis simultánea de hasta 6 geles de 19 x 17 cm.
  • Programa de análisis de imágenes de geles bidimensionales PDQuest.
  • Exquest Spot Cutter (BIO-RAD), para la detección y escisión automática de spots de geles teñidos con plata, azul de Coomassie o con tinción fluorescente SYPRO Ruby.
  • Digestor de proteínas INTAVIS para la realización de forma automatizada todo el proceso comprendido desde la digestión tríptica “en gel” hasta la preparación final de las muestras en la placa de MALDI.
  • Espectrómetro de masas de MALDI-TOF-TOF Autoflex III (Bruker) que permite determinar masas moleculares, identificar proteínas mediante su huella peptídica y fragmentar péptidos para conocer su secuencia.
  • Espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) dotado de una fuente de ionización nano (Proxeon) conectada en línea a un nano-HPLC Easy-LC (Proxeon). Es un equipo híbrido que combina la rapidez y la sensibilidad de una Trampa Iónica Lineal de doble celda y presión independiente, con la alta resolución y la exactitud de masa de la tecnología Orbitrap. Contiene dos analizadores de masas capaces de detectar iones y recoger espectros: la Trampa Iónica (LTQ Velos) y el Orbitrap. Dependiendo de los requerimientos del análisis los dos analizadores se pueden usar de forma independientemente o coordinada. El analizador de masas de Trampa Iónica permite múltiples niveles de fragmentación (normalmente descritos como MSn) y la incorporación del Orbitrap amplía los modos de fragmentación (HCD). El sistema está pensado para la identificación de proteínas en proteomas complejos (p.e identificación de proteínas en bandas de geles 1D, inmunoprecipitaciones, etc), la identificación de sitios de fosforilación u otras modificaciones, así como para la realización de experimentos de proteómica cuantitativa diferencial (SILAC, iTRAQ, Label-free).
  • Espectrómetro de masas Q-Exactive (ThermoScientific) dotado de una fuente de ionización nano (Proxeon) conectada en línea a un nano-UPLC Easy-LC 1000 (Proxeon). Consta de un cuadrupolo, una trampa iónica (C-trap) y un analizador Orbitrap. El Q-Exactive resulta particularmente apropiado tanto para la realización de proteómica “shotgun” como de experimentos SIM (single ion monitoring) y PRM (parallel reaction monitoring), propios de proteómica dirigida (“targeted proteomics”), debido a su configuración. Combina las ventajas del cuadrupolo para filtrado de masas y las del Orbitrap para resolución y precisión de masas. Actualmente Q-Exactive es el único equipo en el mercado que puede funcionar tanto en experimentos de proteómica masiva cualitativa como en los de proteómica dirigida cuantitativa.

 

GENÓMICA

 

El Servicio dispone de las herramientas necesarias para la realización de estudios básicos de genómica funcional y de expresión. Equipos disponibles:

 

  • Nanodrop ND-1000. . Espectrofotómetro UV-visible que permite cuantificar rápidamente ADN, ARN, proteínas, ácidos nucleicos y proteínas marcadas, etc., con un consumo de 1-2 µl de muestra.
  • 2 Sistemas de electroforesis en chip Experion (BIO-RAD). En solo 30 minutos y con un mínimo consumo de muestra, se realiza la separación electroforética y la detección de las bandas de muestras proteínicas de 10-260 kDa (10 muestras/chip), de ARN (12 muestras/chip) y de ADN (11 muestras/chip). Este sistema resulta de gran utilidad para el análisis sistemático de la integridad de las preparaciones de ARN.
  • 2 Termocicladores de PCR en tiempo real (rt-PCR): iQ5 (BIO-RAD) y LightCycler 96 (Roche).. Detección mediante fluorescencia (SYBR Green o sondas específicas) que permite el análisis multiplex de hasta 5 fluoróforos. Se emplean placas de 96 pocillos. Entre sus aplicaciones se encuentran la cuantificación relativa de la expresión génica, la discriminación alélica (SNPs), la cuantificación absoluta, la determinación de la carga viral, el análisis de punto final, etc.

 

 

SERVICIOS OFERTADOS

 

  • Cuantificación de biomoléculas (espectrofotómetro NanoDrop)
  • Electroforesis en chip:
    • de ARN, para la evaluación de su integridad, previa a experimentos de microarrays o rt-PCR;
    • de ADN;
    • de proteínas.

 

PROTEÓMICA

 

  • Separación de proteínas:
    • Electroforesis monodimensional (minigel) en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).
    • Electroforesis bidimensional en condiciones desnaturalizantes.
    • Estimación del punto isoeléctrico de las proteínas de interés.

 

  • Tinción de geles y obtención de imagen:
    • Plata
    • Azul de Coomassie
    • SYPRO Ruby

 

  • Determinación de la masa molecular de material biológico o sintético (MALDI-TOF).

 

  • Identificación de proteínas mediante su huella peptídica y fragmentación de péptidos (MALDI-TOF/TOF).

 

  • Identificación de proteomas completos y mezclas complejas de proteínas por cromatografía líquida masas-masas LTQ Orbitrap Velos.

 

  • Identificación y cuantificación relativa del nivel de expresión de proteínas mediante análisis por espectrometría de masas LTQ Orbitrap Velos (SILAC, iTRAQ, label-free).

 

  • Monitorización selectiva de iones parentales y de sus fragmentos (SIM y PRM, respectivamente) mediante el Q-Exactive en experimentos de proteómica dirigida.

 

  • Determinación de fosfopéptidos.

 

  • Determinación de otras modificaciones post-transduccionales (Consultar).

 

 

 

GENÓMICA

 

  • Análisis cuantitativo y cualitativo de ácidos nucleicos.
  • PCR en tiempo real.
  • Disponemos de la colección de sondas de genoma humano Universal Probe Library de Roche.

 

 

Instrucciones

 

Miembros

Técnicos
Tamar San Hipólito Marín
Postdoctorales
Consolacion Marin Vicente
Técnicos de plantilla
Vivian De los Rios Benítez
Técnicos de Plantilla
Francisco García Tabares