Descripción
En proyectos anteriores, se realizó la caracterización bioquímica y molecular de una esterol esterasa secretada por Ophiostoma piceae. La enzima hidroliza eficazmente mezclas de triglicéridos y ésteres de esteroles de extraíbles de maderas y puede reducir los depósitos generados por estos compuestos durante la producción de pasta de papel. La comparación entre la actividad de varias lipasas y esterasas comerciales y la enzima de O. piceae mostró que ésta es mejor hidrolizando triglicéridos y ésteres de p-nitrofenol y colesterol, en presencia de detergentes. Además, la enzima, expresada en P. pastoris, tiene más eficacia catalítica que la nativa (~ x10), hidrolizando todos los sustratos ensayados. Esta mayor eficacia se explica por la presencia de 6-8 aas más en el N-terminal de la proteína recombinante, que proceden del mal procesamiento del péptido señal en el vector utilizado para su clonación, afectando a su estado de agregación y haciéndola más soluble.
La enzima de O. piceae, al igual que las lipasas, puede llevar a cabo reacciones de síntesis en medios orgánicos. Recientemente se ha demostrado que puede esterificar fitoesteroles libres y es más eficaz que la lipasa de C. rugosa, ya que se requieren menores dosis de enzima y tiempos de reacción. El consumo de ésteres de fitoesteroles contribuye a reducir el colesterol, por lo que estos resultados se recogieron en una patente que propone utilizar la enzima de O. piceae para la síntesis de ésteres de esteroles a partir de un extracto natural con fitoesteroles libres, como alternativa al proceso químico. Además, la esterol esterasa de O. piceae hidroliza polivinil acetato a polivinil alcohol, polímero más soluble y biodegradable, utilizado en numerosas aplicaciones. Esto, unido a que la enzima puede llevar a cabo reacciones de síntesis, sugiere que podría utilizarse tanto en la producción como en el reciclado de poliésteres, procesos que actualmente se llevan a cabo utilizando catalizadores químicos.
Todos los resultados indican que nos encontramos ante un catalizador enzimático robusto, que podía tener diferentes aplicaciones biotecnológicas, aunque existen todavía cuellos de botella para poder comprobar su eficacia a nivel piloto o industrial. Para solventar algunos de ellos, en este proyecto se han planteado varias estrategias. En primer lugar, se ha abordado la expresión de la enzima en hospedadores GRAS, como Saccharomyces cerevisiae, de cara a su potencial uso en aplicaciones relacionadas con el sector alimentario. Las enzimas recombinantes producidas se están caracterizando bioquímica y estructuralmente para comprobar que mantienen sus propiedades catalíticas, profundizar en sus diferencias con las lipasas y finalmente tratar de explicar su eficacia en la hidrólisis y síntesis de ésteres de esteroles, de triglicéridos y poliésteres, todos ellos compuestos de interés industrial. Igualmente, se han iniciado experimentos de inmovilización de crudos con la enzima nativa o la recombinante expresada en Pichia pastoris, ya que el reciclado del catalizador es muy interesante de cara a su utilización industrial.
Otra faceta del presente proyecto se basa en la búsqueda “in silico” de nuevas esterol esterasas, semejantes a la de O. piceae, utilizando bases de datos públicas para seleccionar los genes de enzimas fúngicas, y metagenotecas bacterianas para los de procariotas. El fin último de estos experimentos es la expresión de proteínas funcionales en el hospedador heterólogo más adecuado para cada una de las proteínas elegidas y la comparación de sus propiedades catalíticas con las de la esterol esterasa de Ophiostoma.
Miembros