Descripción
En Junio de 2004 se publicó (Nat. Biotechnol. 22, 695) el borrador del genoma completo del hongo Phanerochaete chrysosporium. El hecho de que el primer basidiomiceto cuyo genoma se encuentra disponible (http://www.jgi.doe.gov/) sea una especie utilizada en numerosos estudios sobre biodegradación de la lignina es indicativo del interés que presenta este tipo de organismos (y sus enzimas) para diferentes aplicaciones biotecnológicas. Esta situación es muy prometedora para avanzar en estos estudios ya que permitirá identificar y caracterizar el conjunto de las enzimas y otras proteínas implicadas. La degradación de la lignina es un proceso extracelular complejo en el que participan oxidasas productoras de peróxido de hidrógeno y peroxidasas de alto potencial redox que catalizan la degradación oxidativa (“combustión enzimática”) de este polímero por el peróxido de hidrógeno. En el presente proyecto se estudiarán a nivel molecular las reacciones catalizadas por oxidasas y peroxidasas descritas recientemente por nuestro grupo, así como por las nuevas oxidorreductasas cuyos genes se identifiquen durante el análisis del genoma de P. chrysosporium. Para el análisis funcional y estructural de los productos de estos nuevos genes será necesario optimizar un sistema de expresión heteróloga adecuado. Con este fin se investigará tanto la expresión eucariota de los genes con sus intrones como la expresión procariota del cDNA (y posterior activación in vitro en su caso). Las enzimas y otras proteínas de interés (identificadas en el análisis genómico o recientemente descritas por nuestro grupo) serán objeto de una caracterización estructural y funcional incluyendo, entre otros, estudios de difracción de rayos-X (estructura general), resonancia magnética nuclear (NMR) cuando se requiera en estudios de metaloproteínas, cinética rápida (intermediarios del ciclo catalítico) y de estado estacionario (comparación de actividades y afinidades), interacciones macromoleculares (con la lignina) mediante técnicas avanzadas de dispersión de luz, resonancia paramagnética electrónica (EPR, detección de radicales), voltametría cíclica (potencial redox), dinámica y acoplamiento molecular (predicción de sitios activos y otras propiedades) y mutagénesis dirigida (confirmación de los residuos supuestamente más relevantes). Finalmente se evaluará el potencial biotecnológico de las diferentes oxidorreductasas estudiadas, y las variantes obtenidas mediante técnicas de mutagénesis, basándose en sus propiedades catalíticas sobre sustratos modelo de lignina (y otros compuestos de alto potencial redox) y su estabilidad en unas condiciones de trabajo (pH y temperatura) similares a las que serían deseables para su futura utilización como biocatalizadores industriales.